成体干细胞来源类器官

提供正常及肿瘤类器官的代培养、复苏、传代、样本库构建等。临床样本来源包括手术切除样本、穿刺活检样本、胸腹水样本等。此外，还可提供罕见疾病样本来源的类器官模型构建，根据客户需求进行个性化类器官培养。交付内容包括：类器官冻存管：P0-P2代，2管，每管类器官数量不少于1000个，细胞量不少于5×10^5个。培养报告：明场照片（每代次1张，含跟踪记录）、HE染色、支原体检测报告、STR鉴定报告（可选）。

↑ 类器官模型构建交付内容举例：A. 人小肠组织来源的类器官(原代)明场照片。B. 人小肠类器官(传代)明场照片。C. 人小肠组织HE染色结果。D. 人小肠类器官HE染色结果。E. 人肺小细胞癌肿瘤组织来源的类器官(原代)明场照片。F. 人肺小细胞癌类器官(传代)明场照片。G. 肿瘤组织HE染色结果。H. 类器官HE染色结果。I. 支原体检测报告。J. STR鉴定报告。比例尺：100 μm。

iPSC来源类器官

诱导多能干细胞（iPSC）是一种将成熟体细胞重编程为具有类似胚胎干细胞特性的多能干细胞。这些细胞具有分化成多种细胞类型的能力，在再生医学和疾病模型研究中具有巨大潜力。iPSC源性类器官由iPSC分化而来，能够在体外模拟特定器官或组织的结构和功能。

iPSC衍生肝类器官

↑ iPSC衍生肝类器官的培养及鉴定A. 诱导内胚层分化(D5-D9)。B. 诱导肝祖细胞分化(D9-D24)。C. 肝类器官成熟(D24-D45)。比例尺：50 μm。D. 免疫荧光染色显示胆管细胞标志物(CK7，绿色)、细胞色素P450酶标志物(CYP3A4，红色)及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。E. 免疫荧光染色显示肝细胞标志物(ALB，绿色)、肝祖细胞标志物(SOX2，红色)及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。比例尺：100 μm。

iPSC衍生心脏类器官

↑ iPSC衍生心脏类器官的培养及鉴定A. 诱导中胚层分化(D0-D4)。B. 诱导心脏类器官分化，出现自主搏动(D10-D12)。C. 心脏类器官成熟(D12-D35)。比例尺：50 μm。D. 免疫荧光染色显示成纤维细胞标志物(Vimentin，绿色)及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。E. 免疫荧光染色显示心肌细胞标志物(CTnT，绿色)、血管平滑肌细胞标志物(α-SMA，红色)及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。比例尺：100 μm。

iPSC衍生内耳类器官

↑ iPSC衍生内耳类器官的培养及鉴定A. 诱导拟胚体分化(D0-D8)。B. 诱导内耳类器官分化，形成耳泡(D15)。C. 内耳类器官成熟(D18-D60)。比例尺：50 μm。D. 免疫荧光染色显示两种毛细胞标志物(ANXA4，绿色；MYO7A，红色)及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。E. 免疫荧光染色显示两种听觉神经元标志物(PROX1，绿色；MPA2，红色)及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。比例尺：100 μm。

类器官面积/数量检测

利用AI或图片分析软件对检测样本中的类器官数量和面积进行统计，评估不同浓度药物作用后的形态改变。

↑ 类器官计数及面积测量案例：子宫内膜癌类器官药物敏感性检测结果，使用AI统计类器官数量和大小/面积。

利用类器官计数软件进行细胞计数，可对样本中的类器官进行准确的量化。

↑ 类器官计数及面积测量案例：A. 使用类器官计数软件对类器官的数量/面积进行计数。B. 使用类器官测量软件测量20例胃癌类器官在使用山奈酚(Kaempferol)处理后的相对面积。C. 1号患者[P(V)1]胃癌类器官在使用山奈酚处理后不同时间明场图。比例尺：200 μm。

CTG发光法

CTG发光法基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对细胞内三磷酸腺苷（ATP）进行定量检测明确类器官培养物中活细胞数目及细胞活力。CTG特有均质检测法，即“加样-混样-检测”，使用时只需将试剂等体积添加至培养物中即可进行检测，比MTT的处理速度快近20倍。

CCK-8细胞活性检测法

CCK-8试剂中含有水溶性的四唑盐WST-8，可被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒。生成的甲瓒数量与活细胞的数量成正比，可使用比色法进行定量分析。

EdU活性检测法

EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可被细胞摄入并整合到DNA中。通过与荧光染料结合，EdU可以在细胞增殖过程中被特异性地检测。该反应非常迅速，因此被称作点击反应。通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，此时可以使用荧光检测设备，检测细胞增殖状况。

钙黄绿素/PI染色法

活死细胞染色是一种非常便捷的基于Calcein-AM（钙黄绿素）和PI（碘化丙啶）双荧光染色法检测细胞活性的染色方法。Calcein-AM可以对活细胞进行荧光染色，其在Calcein的基础上增加了乙酰氧基甲酯（AM）基团，很容易穿透细胞膜。Calcein-AM进入细胞后可被活细胞中酯酶水解生成可发出强绿色荧光的Calcein。PI是核酸红色荧光染料，其不能穿透活细胞的细胞膜，只能进入死细胞。因此Calcein-AM与PI联合使用可对活细胞和死细胞同时进行双重荧光染色。

↑ 类器官活死细胞染色：A. 人食管癌类器官明场图。B. 人食管癌类器官Calcein-AM(钙黄绿素)染色图。C. 人食管癌类器官PI(碘化丙啶)染色图。D. ABC组合图。比例尺：200 μm。

SYTOX Green染色法

SYTOX Green死细胞核酸染料是一种可穿过受损细胞质膜而不能透过活细胞质膜的绿色核酸染料，其与核酸结合之后荧光强度会得到显著增强。可以利用带有450-490 nm激发光源的激发器激发染料，从而获得荧光图像进行进一步分析。

↑ SYTOX Green染色：A. 人食管癌肿瘤组织来源的食管癌类器官明场图。B. 食管癌类器官的SYTOX Green染色。C. A与B重叠后的结果，可观察到食管癌类器官中发生死亡的细胞情况。比例尺：100 μm。

CRISPR基因编辑技术

使用CRISPR基因编辑技术在类器官内完成特定基因的敲入或敲除。CRISPR基因编辑技术将crRNA与Cas9蛋白形成复合物，在sgRNA指引下，crRNA/Cas9复合物可靶向目的DNA区域定向切割DNA，从而达到基因编辑目的。

↑ 类器官CRISPR基因编辑技术A. CRISPR基因编辑技术示意图。B. 用携带Sall2 sgRNA的载体对小鼠小肠类器官进行电转，使用FACS分选后扩增类器官。使用Sanger测序和Synthego的ICE工具验证Sall􄬭基因的成功敲除。上传Sall2敲除和野生型序列，并使用基因敲除得分和每个序列的相对贡献进行比较。C. 野生型(WT)、非靶向对照(NT)和Sall2敲除(C5)的类器官中Sall2蛋白表达Western Blot结果，*标记了 Western Blot中的非特异性条带。

慢病毒转染技术

利用慢病毒载体实现外源基因递送或基因表达干扰。类器官扩增后分散成单个细胞，将这些单个细胞与慢病毒颗粒混合后接种在基质胶中孵育。加入筛选压力继续培养（如嘌呤霉素），经过1-3周的筛选，最终得到稳定的基因修饰类器官。

↑ 慢病毒转染技术：A. 慢病毒转染技术示意图。人结肠类器官(B)、食管癌类器官(C)转染带GFP慢病毒后的图像。

与肿瘤反应性T淋巴细胞共培养

与CAR-T细胞共培养

患者来源的肿瘤类器官与CAR-T淋巴细胞共培养可用于评价CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

↑ CAR-T细胞杀伤肠癌类器官的实时示踪：绿色荧光标记CAR-T细胞，左上角为共培养时间。比例尺：200 μm。

与巨噬细胞/成纤维细胞共培养

肿瘤类器官与巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞（CAF）共培养能够更真实地模拟肿瘤微环境中的细胞间相互作用，从而更准确地预测药物反应和耐药机制。这种共培养模型有助于揭示免疫抑制和基质重塑在肿瘤进展中的作用，为开发靶向肿瘤微环境的治疗策略提供可靠平台。

↑ 类器官与巨噬细胞/成纤维细胞共培养：A. 将小鼠食管癌类器官、相同背景来源的巨噬细胞以及CAF共培养。培养至Day 3，可见狭长状成纤维样细胞、圆形巨噬细胞以及呈现分层的食管癌类器官。B. H&E染色结果。C-E. 使用免疫荧光染色观察巨噬细胞(CD63，红色)与类器官(PANCK，绿色)的共定位。PANCK 阳性细胞主要分布于靠近腔内位置，巨噬细胞散布于类器官周围，未浸润至类器官中。成纤维细胞则倾向于靠近肿瘤类器官生长以便于两者的信号传递。

类器官血管化模型

与内皮细胞共培养

通过将胶原纤维束作为支架材料与类器官、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共同包埋于纤维蛋白水凝胶中，利用成纤维细胞生长因子和肝素促进内皮细胞自组装形成血管网络。

↑ 肠类器官与内皮细胞共培养：A. 肠类器官呈圆形，绿色荧光标记的HUVEC已开始呈短枝状分布，初步形成血管网络。B. 类器官增多，HUVEC已形成复杂的网状血管结构。

与血管类器官共培养

利用干细胞构建血管化脑类器官，即将hPSC培养形成拟胚体后，分别分化为神经上皮和血管祖细胞球，将两者在基质胶中融合培养，促进血管类器官与脑类器官实现结构整合，形成最终的血管化脑类器官。

↑ 血管化脑类器官的构建：A. 共培养第5天，血管团(黑色三角)与发育中大脑类器官开始融合。B. 在共培养第13天观察到CD31(红色)染色的内皮细胞。C. 血管化脑类器官的CD31(红色)阳性内皮网络被SMA(绿色)阳性平滑肌细胞包裹，类似典型的血管结构 。

肠类器官共培养模型

肠粘膜屏障保护人体内部免受微生物和抗原的侵害，同时允许水、营养物质和特定分子的运输。肠上皮细胞单层排列在肠道表面，并不断更新。上皮细胞之间由多种蛋白组成紧密连接，与其他类型的细胞一起共同形成完整的功能调控单元。为此，利用类器官建立肠粘膜屏障以研究宿主与肠道微生物之间的相互作用，为阐明包括炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎等在内的肠道疾病的发病机制带来了许多新的可能性。

↑ 肠类器官共培养模型的类型：A. 肠类器官显微注射模型。将微生物通过显微注射的方式注射进肠类器官中，缺氧环境有利于研究厌氧菌或兼性厌氧菌。B. 肠类器官肠腔外翻模型。利用螯合剂EDTA破坏二价阳离子依赖的细胞外基质蛋白层中粘连蛋白的聚合，再使用低附着力平板继续悬浮培养类器官后，可获得肠腔“外翻”的肠类器官。C. 肠类器官单层培养模型。将肠类器官消化成小细胞团/单细胞后移植到涂有细胞外基质的Transwell小室上形成单层类器官。微生物可通过添加到培养基中引入，但这种模型无法与严格厌氧菌共培养，因为该培养模型要保持在有氧条件下才能保证类器官的存活。

↑ 肠类器官单层培养模型纵切的免疫荧光染色结果：A. 免疫荧光染色结果显示肠内分泌细胞标志物(CHGA，绿色)、紧密连接蛋白(ZO-1，红色)以及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。B. 免疫荧光染色结果显示潘氏细胞标志物(Lyz，绿色)、紧密连接蛋白(ZO-1，红色)以及细胞核标志物(DAPI，蓝色)。C. 免疫荧光染色结果显示杯状细胞标志物(Muc2，绿色)、紧密连接蛋白(ZO-1，红色) 以及细胞核标志物(DAPI ， 蓝色)。比例尺：200 μm。

↑ 肠类器官共培养模型相关研究：A. 小肠类器官源肠粘膜屏障中引入李斯特菌，Actin染细胞骨架(绿色)，LTA染李斯特菌(黄色)。B. 李斯特菌与Muc2染色杯状细胞(红色)共定位。C. 李斯特菌附近Actin荧光密度下降，提示其可引起Actin重新分布。比例尺：10 μm。